今年上半年國內(nèi)一研究機構(gòu)向我司采購了一套倒置顯微鏡觀察系統(tǒng)，包含了一臺倒置熒光顯微鏡、CCD相機、恒溫?zé)崤_等。今年上半年我司接到一個來電，咨詢倒置顯微鏡，需要采購一套，但是由于咨詢?nèi)藛T不了解顯微鏡，沒有給我們明確的顯微鏡配置要求。于是我司安排專業(yè)的技術(shù)人員與她溝通，經(jīng)過仔細(xì)了解才知道他們是用來研究人體胚胎的，旨在找出不孕不育癥的治療良方。恰好，我司在這方面的應(yīng)用已經(jīng)有一定的經(jīng)驗，于是我們技術(shù)員向這位貴賓詳細(xì)解釋了顯微注射的原理和操作步驟。
所謂顯微注射就是在顯微鏡下挑選活力較佳的精子，將精子直接注射成熟的卵子內(nèi)，然后將其重新放回婦女的子宮，從而提高受孕幾率。這項技術(shù)的詳細(xì)過程如下：
第1步.顯微注射系統(tǒng)最主要的儀器包括倒置顯微鏡和置于它兩側(cè)的顯微操作儀。倒置顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)應(yīng)具有三維立體視覺，對精子形態(tài)觀察可以細(xì)致入微，辨別優(yōu)劣。載物臺配置37℃恒溫透明載物臺，以保證注射時卵子的溫度恒定。操作儀的持卵側(cè)容易控制，持卵針可自己拉制。持卵針的前端要平滑，內(nèi)徑要小，以免吸進(jìn)卵細(xì)胞質(zhì)。持卵針外徑要比卵的直徑略小為宜。
操作儀的注射有兩個關(guān)鍵性問題要注意：
第一，注射側(cè)的整個壓力傳導(dǎo)系統(tǒng)一定要密閉，且操作要靈敏。傳導(dǎo)系統(tǒng)的塑料管內(nèi)充填的 無論是油質(zhì)還是水質(zhì)材料以不產(chǎn)生氣泡為佳。一旦有氣泡產(chǎn)生，說明壓力傳導(dǎo)系統(tǒng)有漏氣，定將導(dǎo)致精子的吸入和推出不能控制自如，注射過程不能順利完成。注射系統(tǒng)的塑料管是透明的，有氣泡能及時發(fā)現(xiàn)。固定注射針的固定器有金屬和有機玻璃兩種，有機玻璃的固定器是透明的，如有氣泡產(chǎn)生易于發(fā)現(xiàn)而及時排除。但使用何種操作系統(tǒng)，要根據(jù)操作者的習(xí)慣來選擇。
第二個關(guān)鍵性問題是注射針的質(zhì)量，注射針口徑的大小和注射針尖的銳利程度關(guān)系到精子注入的成敗，一旦發(fā)現(xiàn)針的質(zhì)量有問題，不可勉強湊合使用，應(yīng)及時更換。
第2步.精子制動與注射持卵針和注射針分別安裝到固定器上，持卵針和注射針要調(diào)至一個平面水平，左右呈一條直線。注射針的前端要與皿底平行。
第3步.將準(zhǔn)備好的上游精子用拉制好的細(xì)玻璃管吸幾個微升至培養(yǎng)皿中的PVP滴中，在20倍物鏡下尋找形態(tài)正常、游動的精子，用注射針的前端貼培養(yǎng)皿底壓住精子尾部中段，注射針對尾部施壓摩擦至擦破尾部的質(zhì)膜，然后先尾部后頭部將精子緩慢吸入注射針前端。精子制動目的不僅使注射針易于控制精子的吸人，另一目的是從尾部擦破點釋放出的精子細(xì)胞質(zhì)和卵子的激活有關(guān)。
第4步.準(zhǔn)確無誤地將質(zhì)量好的精子吸入注射針前端，并能控制精子在前端移動速度至關(guān)重要，控制精子的移動要達(dá)到從PVP滴移到培養(yǎng)液小滴的過程中不丟失精子。如果能在注射針中一次轉(zhuǎn)移三個精子，且各精子之間保持一定距離，就可以加快注射速度和縮短卵子在培養(yǎng)箱外的時間。卵子在培養(yǎng)箱外的時間不宜超過30分鐘，最好每組卵注射時間在15分鐘內(nèi)完成，并及時將已注射的卵放回培養(yǎng)箱中。卵子放人注射皿的時間和方式根據(jù)操作者自己來定，只是要注意對卵子的保護(hù)問題。筆者的體會是，最好是注射針從PVP滴吸好精子轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)滴后，以嘴吸控制的方式將卵子移進(jìn)位于顯微鏡載物臺上的注射皿中，以防從載物臺移開注射皿，造成注射針多次暴露在空氣中易引起注射針的堵塞或污染。
第5步.在低倍鏡下將吸有精子的注射針以移動注射皿的方式進(jìn)入放有卵子的培養(yǎng)滴，持卵針降下到皿底的培養(yǎng)液滴吸住卵子，將第二極體定位在7點的位置。從理論上講，紡錘絲在第二極體下方，但實際上極體可能錯位，如果能在偏振光顯微鏡頭的監(jiān)察下避開紡錘絲注射更為理想。好的持卵針能穩(wěn)固地吸牢卵子，卵子可接觸皿底，也可懸空，兩種位置都不影響注射。
完成上述工作，鏡頭換成高倍鏡，清楚聚焦3點鐘位置的透明帶和注射針尖。緩慢將精子推向針尖并快速刺入卵細(xì)胞內(nèi)。卵的質(zhì)膜具有高度韌性和彈性，往往針尖已深達(dá)9點的位置卵膜仍然不破。質(zhì)膜已破的標(biāo)準(zhǔn)是回吸精子時卵細(xì)胞質(zhì)無阻礙順暢地流進(jìn)針管，此時即可向卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射精子，如質(zhì)膜未破則將針退回到透明帶3點處換方向再行穿刺，直到將質(zhì)膜刺穿精子被注射進(jìn)卵子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨后才可能發(fā)生受精過程。質(zhì)膜不破，精子留在注射過程形成的質(zhì)膜凹陷內(nèi)，卵子不能受精。
第6步.精子注射5至6小時后，可形成雌性和雄性原核。在臨床的IVF中心，一般注射后第二天清晨檢查受精情況。平均顯微注射受精成功率應(yīng)在80%以上，其中一個雌性原核一個雄性原核的2PN受精卵占總受精的90%左右;兩個雌性原核(第二極體、未排卵)一個雄性原核的3PN受精卵時有發(fā)生，約占5%一10%，個別情況可達(dá)30%;l PN發(fā)生的情況約占5%。注射后第二天晨觀察到的受精卵的兩個原核應(yīng)已經(jīng)靠近，如果離的較遠(yuǎn)預(yù)示發(fā)育不良。
通過上述詳細(xì)的介紹，這位老師非常認(rèn)同我司技術(shù)人員的專業(yè)知識和專業(yè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆?wù)態(tài)度，立刻決定向我司采購本套產(chǎn)品。一個月后我司人員上門安裝此套產(chǎn)品，到目前使用情況，客戶反應(yīng)良好。
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