顯微鏡檢法之落射熒光法

落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）簡(jiǎn)稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長(zhǎng)較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波長(zhǎng)，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調(diào)整方法：熒光顯微鏡|顯微鏡攝像頭|顯微鏡接口或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。

① 汞燈的安裝：
a.打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對(duì)向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)；
b.把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定；
c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。
d.詳細(xì)的安裝方法請(qǐng)參照有關(guān)說明書。

② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：
a.接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min；
b.把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對(duì)地高度一樣的水平線作為參考線；
c.轉(zhuǎn)動(dòng)燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上；
d.分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。

③ 汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：
a.將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場(chǎng)光闌開到最大；
b.把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼；
c.把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺(tái)上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；
d.取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì)有一藍(lán)色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。
e.調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光；
f.仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。

④ 汞燈使用注意事項(xiàng)　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對(duì)鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個(gè)大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。
a.汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時(shí)間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電；
b.汞燈在使用過程中，不要隨意開關(guān)汞燈的電源；
c.關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時(shí)，將會(huì)造成嚴(yán)重后果！由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強(qiáng)大的電流，輕則燒斷保險(xiǎn)絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會(huì)炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件。
d.汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當(dāng)可達(dá)600h，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價(jià)格及昂貴，應(yīng)珍惜使用。
e.汞燈壽命終結(jié)的標(biāo)志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。